植物过氧化物酶(POD)检测试剂盒(愈创木酚微板法)的计算

产品简介：

过氧化物酶(peroxisome，POD)是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢，氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用，该酶属于细胞木质素合成途径中间的关键酶，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。植物过氧化物酶(POD)检测试剂盒(愈创木酚微板法)检测原理是以愈创木酚(又称 2-甲氧基酚)作为底物，在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，于酶标仪 470nm 处测定吸光度，以吸光度变化所需酶量进行计算，主要用于植物组织的裂解液或匀浆液、血清等样品中内源性的过氧化物酶活性，尤其适用于测定水果中过氧化物酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。 

自备材料：

1、蒸馏水

2、研钵或匀浆器

3、离心管

4、低温离心机

5、水浴锅或恒温箱

6、96 孔板、酶标仪

操作步骤(仅供参考)：

1、准备样品：

①植物样品：取 0.5-1.0g 植物组织或水果中层果肉加入 4ml 预冷的 POD Lysis Buffer

研磨或匀浆，4℃ 10000g 离心 15~20min，留取上清液，即为 POD 粗提液，-20℃冻

存，用于过氧化物酶的测定。

②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于该试剂盒的测定，-20℃冻存，用于过氧化物酶的测定。

③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用 POD Lysis Buffer 进行适当匀浆，4℃ 10000g 离心 15~20min，留取上清液，即为 POD 粗提液，-20℃冻存，用于过氧化物酶的测定。

④高活性样品：如果样品中含有较高活性的过氧化物酶，可以使用 POD Lysis Buffer 进行恰当的稀释。

2、配制 POD Assay Buffer 工作液：取适量的 POD 氧化剂和 POD Assay Buffer，按 POD氧化剂：POD Assay Buffer=1：14 混合，即为 POD Assay Buffer 工作液，即配即用，不宜久置。

3、POD 加样：取 96 孔板，按照下表设置对照孔孔、测定孔，注意：对照孔、测定孔中为同一待测样品，但对照孔中是提前加热煮沸 5min 的样品；溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡，如果样品中的 POD 活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置 2 平行孔，求平均值。

4、POD 测定：立即以酶标仪，以对照孔为对照，测定 470nm 处测定孔的吸光度(A 测定 0)；

37℃准确孵育 3min 后，立即加入 5μl POD 终止液终止反应(备选方案)，以对照孔为对

照，以酶标仪测定 470nm 处测定孔的吸光度(A 测定 1)。注意：加入 POD 终止液终止反

应不是必须步骤，可 37℃准确孵育 3min 后，以对照孔为对照，直接以酶标仪测470nm 处测定孔的吸光度(A 测定 1)。

计算：

POD 活性单位的定义：在该实验条件下，每 1min 吸光度变化 0.01 所需酶量为一个活

性单位。

组织样本 POD(U)={(A 测定 1-A 测定 0)×VT}/(W×VS×0.01×t)

式中：A 测定 1=孵育 3min 后测定孔的吸光度值

A 测定 0=加入 POD Assay buffer 工作液后测定孔的吸光度值

W=组织样本的重量(g)

VT=提取酶液的总体积(ml)

VS=测定时所用酶液体积(ml)

t=反应时间

液体样本 POD(U)=(A 测定 1-A 测定 0)/(0.01×t)

式中：A 测定 1=孵育 3min 后测定孔的吸光度值

A 测定 0=加入 POD Assay buffer 工作液后立即测定的测定孔吸光度值

t=反应时间

注意事项：

1、 待测样品中不能含有酶抑制剂，同时需避免反复冻融。

2、 POD 酶液提取时，注意低温操作，防止酶活性。

3、 以煮沸的酶液为对照时，酶要充分失活。

4、 POD 氧化剂和 POD 终止液具有一定腐蚀性，请小心操作。

5、 POD 氧化剂易挥发，请密闭保存，否则检测效率下降。

6、 如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，每次检测指标不宜过多，否则操作时间不一，有可能导致样本间的差异。

7、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：6 个月有效；常温运输，4℃保存。

 

植物过氧化物酶(POD)检测试剂盒(愈创木酚微板法)的计算