PCR实验代测的模板浓度

 

 服务内容：

 

1.制定个性化实验方案：根据不同的实验目的确定实验方案、选定合适的内参；

 

2.检测类别：mRNA、miRNA、lncRNA、DNA；

 

3.样本抽提及质检：对客户提供样本进行RNA抽提，并利用NanoDrop进行样本质检；

 

4.定量PCR预实验：包括样本反转录为CDNA、配置PCR反应体系及进行Real-TimePCR反应；

 

5.正式定量PCR实验：根据预实验结果进行正式实验；

 

6.数据分析：采用2- △△CT法进行分析，比较不同样本间差异。

 

影响Ct值的关键因素

 

模板浓度

 

模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内，使Ct在15-35之间

 

反应液成分的影响

 

任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。

 

PCR反应的效率

 

PCR反应的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。

 

Real-time qPCR常见参数

 

基线（baseline）通常是3-15个循环的荧光信号

 

同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线

 

阈值（threshold）

 

自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍

 

手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强

 

同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。

 

Ct值:与起始浓度的对数成线性关系。

 

分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。

 

Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。

 

△Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn-基线）。

 

如何评估实时定量PCR反应的效果

 

PCR扩增效率：为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。

 

另一个评估PCR效率的关键参数是相关系数R2，它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）来准确预测X值（量）。如果R2等于0，你就不能通过Y值来预测X值。R2值大于0.99 时，两个数值之间相关的可信度很好。

 

PCR实验代测的模板浓度