信帆生物带您了解：Western Blot实验应该如何选择正确的抗体

很多老师在做 实验的时候，不知道应该如何来选择正确的一抗和二抗，信帆生物为您答疑解惑。上海信帆生物专业提供Western Blot实验检测服务，PCR实验检测服务，免疫组化，免疫荧光检测服务，放射免疫检测服务，为您的实验助力！

首先要看你做的是什么物种，根据物种特异与否选择单抗或者多抗。

一般小鼠、大鼠等常用模式动物可以选择鼠源单克隆抗体，其特异性较好，如果是不常见动物模型，建议选择多克隆抗体。

当然，单抗或者多抗也不是一定的，需要去查询抗原决定簇的归属，一般是找到抗体所对应的特异氨基酸序列，到数据库与你要做的物种进行比对，如果匹配度较高（85%以上），则建议购买尝试。

二抗的选择相对就简单了，根据一抗的种属特异性进行二抗选择即可。

如一抗选用鼠源（Mouse）抗体，则二抗选用抗小鼠抗体即可（e.g. Goat Anti-Mouse），注意二抗的反应特性（荧光、生物素或HRP偶联等）

其次就是多查阅文献，查看和Western Blot实验相关的SCI文献，查看要做的种属和指标关联度高的文献。

信帆生物带您了解：Western Blot实验应该如何选择一抗和二抗

抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgE五类，它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon链。在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四个亚类。 轻链分为两种类型，kappa链和lambda链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。 二抗：二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），ELISA（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。

二，如何选择二抗——根据一抗种属及类型选择合适的二抗

广义上是指专门和进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，上海信帆生物科技有限公司为您的科研工作提供适合和全面的二抗产品。检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】

二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。

二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG。

一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时候，二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。有相应的驴来源的二抗，非常适合做类似双标的免疫实验。【二抗的耦联标记】

一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物，PAP），荧光基团（FITC、 Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等）、生物素、金颗粒。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于Western Blot和ELISA，常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin检测系统。在一些荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记；而金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。

信帆生物带您了解：Western Blot实验应该如何选择正确的抗体