免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。

老师在做 免疫印迹（WB）实验时候，需要先告知我司销售人员是做整模还是减膜，具体如图。另外本公司提供大膜和小膜两种规格的膜，大膜一个指标可以测1到13个样本，小膜一个指标可以测1-8个样本。

整膜如图：

 

减膜如图：

 

Western blot样本要求

客户需新鲜或正确保存的蛋白样品， 检测目的蛋白的一抗（或由本公司代购）。样品要求为：

 

1、裂解样品总蛋白量>500ug/样品。

2、细胞样品总蛋白浓度>1mg/ml。

3、组织样品总蛋白浓度>10-15mg/ml。
 

Western blot结果及数据提供

内参蛋白和目的蛋白曝光胶片各一张，可提供扫描图，实验报告，包括整个试验流程所涉及的实验数据和实验步骤。如需进行蛋白纯化服务，将提供检测报告

WB实验代测

服务内容

我们提供从蛋白制备、蛋白电泳到Western blot检测的全流程服务，如需要还可进行灰度分析。

说明

1、建议提供目的蛋白阳性表达样品（纯蛋白或有阳性表达的细胞或组织）作为阳性对照。

2、每张膜检测1-8个样品。

3、如果一抗由客户提供，请在正确条件下保存，避免污染及反复冻融。

 

 

关于Western blot实验异常分析

『无信号』

原因	建议
一抗与二抗不匹配	选择针对一抗来源种属制备的二抗；
一抗不识别目的的种属的蛋白	1)检查抗体的说明书，适用范围内是否包含目的种属            2)使用阳性对照来检查抗体质量
一抗或二抗不足，没有足够的抗体结合到目的蛋白	1)降低抗体稀释倍数，增加抗体浓度            2)延长孵育时间
封闭剂与一抗有交叉反应	改变封闭剂
抗原不足	1)每个泳道加入20-30ug总蛋白            2)制备样品要使用蛋白酶抑制物及使用阳性对照
在检测的组织内目的蛋白表达水平低	检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性，也可更换细胞系
蛋白转膜效率低	1)利用丽春红检测转膜效率;检查转移装置是否电极弄反            2)转移前膜是否用甲醇侵泡过
膜过渡洗涤	减少洗涤时间和强度
叠氮钠抑制二抗活性	二抗稀释液内不用叠氮钠

 

 

『没有特异条带』

原因	建议
细胞系传代过多后蛋白表达谱发送变化	1)使用未传代或传代次数较少的细胞系进行样品制备
蛋白本身有很多修饰	1)查阅文献，确定目的蛋白是否存在多种修饰
蛋白被消化或者降解	1)蛋白样品确保未被污染，确保含有蛋白酶抑制剂
所检测蛋白存在多种剪接体，导致分子量大小不同	1)查阅文献或者通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种长度不同的编码mRNA
一抗或二抗浓度高	1)减低抗体浓度
洗涤不够	1)充分洗涤

 

 

『条带大小不正确』

原因	建议
目的蛋白被降解	确保蛋白样品未被污染，确保含有蛋白酶抑制剂
存在不同的剪接体	查阅文献或者通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种长度不同的编码mRNA
重组蛋白	检测是否存在额外加入的蛋白
特殊蛋白如MDM2等	仔细阅读抗体说明书

 

 

 

尊敬的客户：
本公司有放射免疫技术服务、蛋白质组学服务、免疫组化、PCR技术服务、生物信息学数据分析等，如果您想了解Western blot的更多内容或者其他服务信息，您可以本公司的了解更多产品的详细信息，至善至美的服务是我们永无止境的追求，欢迎新老客户放心选购自己心仪产品，我们将竭诚为您服务！

 

WB实验代测