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免疫组化实验代测

发布时间:2017-07-26 09:53 |  点击次数:


免疫组化实验代测
免疫组化,是应用免疫学基本原理一抗原抗体反映,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反映使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

服务说明

冰冻切片免疫组化实验步骤

1、 冰冻切片固定冰冻切片室温晾干,置于冷丙酮固定10min,于PBSPH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min

2、 抗原修复:组织切片置于盛EDTA抗原修复缓冲液PH9.0)修复盒中于微波炉内进行抗原修复。10-15min断电间隔10min转至中低火10-15min此过程中应防止缓冲液过度蒸发,切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min(修复液和修复条件根据组织来确定)

3、 阻断内源性过氧化物酶:切片放入3%过氧化氢溶液,室温避光孵育25min将玻片置于PBSPH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min

4、 BSA或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走),在圈内滴加3%BSA或者10%正常兔血清均匀覆盖组织,室温封闭30min。(一抗是山羊来源用10%正常兔血清封闭,一抗其它来源的用3%BSA封闭)

5、 加一抗:轻轻甩掉封闭液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)

6、 加二抗:玻片置于PBSPH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加组化试剂盒内与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织,室温孵育50min

7、 DAB显色:玻片置于PBSPH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液,显微镜下控制显色时间,阳性为棕黄色,自来水冲洗切片终止显色。

8、 复染细胞核:Harris苏木素复染3min左右,自来水洗,1%的盐酸酒精分化数秒,自来水冲洗,氨水返蓝,流水冲洗。

9、 脱水封片:将切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min --无水乙醇6min -无水乙醇6min -二甲苯Ⅰ5min 中脱水透明,将切片从二甲苯拿出来稍晾干,中性树胶封片。

免疫组化实验代测

 

石蜡切片免疫组化实验步骤

 

1、 石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯15min-二甲苯15min-无水乙醇5min-无水乙醇5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。

2、 抗原修复:组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH9.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复,中火8min至沸,停火8min保温再转中低火7min此过程中应防止缓冲液过度蒸发,切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min

3、 阻断内源性过氧化物酶:切片放入3%过氧化氢溶液(双氧水:纯水=1:9,室温避光孵育25 min将玻片置于PBSPH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min

4、 BSA或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走),在圈内滴加3%BSA或者10%正常兔血清均匀覆盖组织,室温封闭30min。(一抗是山羊来源用10%正常兔血清封闭,一抗其它来源的用3%BSA封闭)

5、 加一抗:轻轻甩掉封闭液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)

6、 加二抗:玻片置于PBSPH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织,室温孵育50min

7、 DAB显色:玻片置于PBSPH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液,显微镜下控制显色时间,阳性为棕黄色,自来水冲洗切片终止显色。

8、 复染细胞核:Harris苏木素复染3min左右,自来水洗,1%的盐酸酒精分化数秒,自来水冲洗,氨水返蓝,流水冲洗。

9、 脱水封片:将切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min --无水乙醇6min -无水乙醇6min -二甲苯5min 中脱水透明,将切片从二甲苯拿出来稍晾干,中性树胶封片。

10、 显微镜镜检,图像采集分析。
免疫组化实验代测