上海信帆生物科技有限公司

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免疫荧光,免疫荧光实验代测

发布时间:2017-07-14 10:29 |  点击次数:


免疫荧光实验代测找上海信帆生物

上海信帆生物代做免疫荧光实验。老师提供样本即可,我司可以进行蜡块切片可提供抗体等。免疫荧光检测我们分单标和双标。

在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时,需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。

免疫荧光实验代测找上海信帆生物

冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤

1、 冰冻切片固定冰冻切片从冰箱拿出来复温,晾干水分,冷丙酮固定10min,待丙酮完全干后于PBSPH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min

2、 修复:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走),在圈内滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释)覆盖组织37度温箱孵育30min将玻片置于PBSPH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min

3、 破膜:切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织,常温下孵育20min将玻片置于PBSPH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min

4、 加试剂1,2:按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂2(dUTP)2:29混合(试剂1,2为现配现用),加到圈内覆盖组织切片平放于湿盒内,37恒温孵育2小时,湿盒内加少量水保持湿度。

5、 BSA封闭:将玻片置于PBSPH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min在圈内滴加3%BSA均匀覆盖组织,室温封闭30min

6、 加一抗:轻轻甩掉封闭液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)

7、 加二抗:玻片置于PBSPH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织,避光室温孵育50min

8、 DAPI复染细胞核:PBSPH7.4洗涤3次,每次5min去除PBS后在圈内滴加DAPI染液,避光室温孵育10min

9、封片:玻片置于PBS(PH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

10、 镜检拍照:切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。(紫外激发波长330-380nm,发射波长420nmFITC绿光激发波长465-495nm,发射波长515-555 nmCY3红光激发波长510-560,发射波长590nm

 

石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤

 

1、 石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯15-20min-二甲苯15-20min-无水乙醇10min-无水乙醇10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗(冬天脱蜡时间稍微延长)

2、 修复:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走),在圈内滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释)覆盖组织37度温箱孵育30min将玻片置于PBSPH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min

3、 破膜:切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织,常温下孵育20min将玻片置于PBSPH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min

4、 加试剂1,2:按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂2(dUTP)2:29混合,加到圈内覆盖组织切片平放于湿盒内,37恒温箱孵育2小时,湿盒内加少量水保持湿度。

5、 BSA封闭:将玻片置于PBSPH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min在圈内滴加3%BSA均匀覆盖组织,室温封闭30min

6、 加一抗:轻轻甩掉封闭液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)

7、 加二抗:玻片置于PBSPH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织,避光室温孵育50min

8、 DAPI复染细胞核:PBS(PH7.4洗涤3次,每次5min去除PBS后在圈内滴加DAPI染液,避光室温孵育10min

9、封片:玻片置于PBS(PH7.4中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

10、 镜检拍照:切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。(紫外激发波长330-380nm,发射波长420nmFITC绿光激发波长465-495nm,发射波长515-555 nmCY3红光激发波长510-560,发射波长590nm

实验操作注意事项:

1、荧光染色后一般在1h内完成观察,或于4℃保存4h,时间过长,可能会使荧光提前衰退。

2、每次试验均需设置以下三种对照:

(1) 阳性对照:阳性血清+荧光标记物;

(2) 阴性对照:阴性血清+荧光标记物;

(3) 荧光标记物对照:PBS+荧光标记物。

免疫荧光实验代测找上海信帆生物